实验储备 | siRNA 转染操作及要点

siRNA（小干扰 RNA）是一种新型的基因治疗工具，是由 21-25 个核苷酸组成的双链短 RNA 分子，能够特异性地诱导靶基因的沉默，进而抑制蛋白的表达。siRNA 最初由 Andrew Fire 和 Craig Melo 在 1998 年提出，之后在 2001 年被证明可以特异性地抑制哺乳动物细胞中的靶基因表达。这一发现由 David Baulcombe 团队在《科学》杂志上发表，成为当年全球十大科学进展之首，他的团队并于 2006 年荣膺了诺贝尔生理学或医学奖。

siRNA 的抑制作用是通过其与 AGO 蛋白组装成的 RNA 诱导沉默复合体（RISC）发挥的。一条链被降解，另一条链则与靶基因的 mRNA 互补配对，使其被切割降解，从而达到治疗相关疾病的目的。与传统的基因治疗相比，siRNA 具有高度特异性、快速、可逆性等优点，可以应用于各种真核生物的基因功能研究，药靶发现及药物筛选中广泛应用。例如 siRNA 靶向恶性肿瘤的基因可以通过局部或系统性给药来治疗肿瘤，病毒感染和遗传疾病也都有涉及。

siRNA 抑制蛋白表达机制

为了方便使用，常规 siRNA 产品以冻干粉形式提供，可以直接用于各种细胞 RNAi 实验。科研人员可以根据需要设计特定靶点，覆盖人、小鼠、大鼠全基因组的所有基因。同时，通过对 siRNA 进行化学修饰，可以提高其在体内实验中的高效性、特异性和稳定性。

RNA 干扰（RNAi）是一种广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程，常常被用作基因沉默（基因干扰）的工具之一。siRNA 作为 RNAi 的一种形式，具有非常广阔的应用前景。未来，siRNA 还将继续发挥其独特的优势，成为治疗相关疾病的新趋势。

siRNA 转染实验介绍

01- siRNA 储存

常规化学合成的 siRNA 序列为 21～23nt 的双链小分子 RNA，为冻干粉形式的即用型试剂  ，在常温不溶解的情况下可以保存至少 1 个月时间，放置于-20℃～-80℃ 低温环境中，冻干粉可以稳定保存一年。

02- 转染试剂储存

4℃ 保存，不可冷冻。

03-体外转染操作流程：

第一步、接种细胞：建议提前一天接种细胞，接种数量参考下方推荐量。

第二步、 转染复合液配制：

● siRNA 稀释液配制：siRNA 以水稀释至 140 μg/mL。

● siRNA 转染复合液配制：取无菌离心管，加入 2μL siRNA 稀释液，加入 LipidnanoTM Super RNAi 转染试剂 A 液 14μL，吹打混匀，加入 LipidnanoTM Super RNAi 转染试剂 B 液 4μL，混合均匀，室温放置 5 min，加培养液 180μL，吹打混匀。

第三步、细胞加样：按下方推荐量将配制好的 siRNA 转染复合液加入各细胞孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

第四步、细胞培养：37 ℃，5% CO2 培养箱培养，直至发挥干扰作用。建议 24～48 h 测定 mRNA 水平、48～72 h 测定蛋白水平。

操作流程示例
 

siRNA 样品加入示例

注：使用本转染试剂对细胞进行 siRNA 转染时，为了获得最佳基因沉默效果，每一种细胞系转染 siRNA 的剂量都需要经过实验确定最佳范围。

示例中使用的体外转染试剂为同立海源生产的 LipidnanoTM Super RNAi 转染试剂，主要应用于：贴壁细胞和悬浮细胞转染，部分原代细胞和转化细胞株的基因转染，siRNA 高通量转染试验。在进行体外转染实验的过程中，实验还需注意这些细节：

❶  转染前，确保 siRNA 是经过 PAGE 纯化和脱盐处理过的，高纯度的 siRNA 或者 miRNA 有助于获得较高的转染效率，并确保  siRNA/miRNA  基因沉默表达不会影响细胞活力。

❷  首次转染：如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个 siRNA 转染试剂复合液浓度，并在 0.014 μg/mL～0.70 μg/mL 范围内改变 siRNA 的浓度，根据首次转染结果调整剂量水平。

❸ siRNA 转染试剂稀释液的选择：对培养基无特殊要求，可使用完全培养基进行稀释，不强要求减/无血清培养基。

❹  浓度换算：摩尔浓度与质量浓度之间的换算关系可根据 siRNA 分子量可进行同步换算。X nmol/L* 分子量 = Y ng/L，如分子量为 14000 的 siRNA，1nmol/L*14000 = 14000ng/L = 14 μg/L。

❺  转染细胞密度：推荐在 70% 左右时进行转染。通常基因沉默的分析要在转染后 24 小时进行。本转染试剂极低的细胞毒性可以方便研究者根据目的细胞生长特性，靶基因的表达特性，选择适合条件进行转染。健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性。通常健康的细胞转染效率较高，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。推荐用 50 代以下的细胞转染。 

❻  阳性对照选择：通过合适的阳性对照、实验 siRNA 优化转染和检测条件，对大多数细胞，GADPH-siRNA 是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照 siRNA 或实验 siRNA 转入靶细胞，转染 24 小时后，以内参基因如 β-actin mRNA 为对照，统计目标 mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。

传统转染试剂可通过表面正电荷帮助 siRNA 大量摄取入胞，但入胞后 siRNA 内含体逃逸水平低，造成摄取的 siRNA 无法发挥作用，同时造成细胞毒性。本品为非强正电性脂质转染试剂，避免细胞大量摄取造成的毒性，但本品可提升细胞内吞后的 siRNA 内含体逃逸效率，通过促进内含体逃逸使更多 siRNA 释放入细胞质中实现高效基因沉默作用。故在细胞水平上通过荧光标记 siRNA 进行条件优化的方法不适用于本转染试剂。推荐使用 Western Blot 或 QPCR 方式对最佳转染浓度进行优化。

❼  操作注意：siRNA 与转染试剂 A 液实现充分混合后加入 B 液，继续混合均匀，放置 5 min 后加入培养基稀释，稀释后需在 1 h 内加入细胞孔内。将 siRNA 转染试剂复合液加至每一个包含细胞和培养基的孔中，加入后可以轻轻地前后摇动培养板混合均匀。

❽  避免 RNA 酶污染：微量 RNA 酶会导致 siRNA 实验失败。由于实验环境中 RNA 酶普遍存在，如皮肤、头发、所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品。因此请确保实验每个步骤不受 RNA 酶污染。推荐使用商业化无酶实验耗材。

❾  效果评价：细胞转染后，不同细胞和 siRNA 效率存在差异。在 mRNA 水平观察 siRNA 效果的最佳时间是转染后 24～48 小时，在蛋白水平观察 siRNA 效果的最佳时间是转染后 48～72 小时。siRNA 干扰是非线性的，不同基因半衰期存在较大差异，首次进行 siRNA 干扰效果测定时，建议多点测定，确定最佳测定时间点。

已验证可高效转染细胞:

BEAS-2B; HEK293; HEK293T; HCT116; HT22; FibroblastP4；MCF-7; B16F10; Hela；HepG2; Raw264.7；AHH-1;H9;   原代小鼠血管内皮细胞；原代小鼠血管平滑肌细胞...

siRNA 沉默效果分析

siRNA 转染细胞后，siRNA 在细胞内一系列酶的作用下形成 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC)，识别并切割靶基因 mRNA，诱发宿主细胞针对这些 mRNA 的降解反应， 从而抑制了细胞内目的基因蛋白的表达，一般可从两个方面进行检测。

mRNA 水平 - qPCR 检测：

siRNA 的作用机理在于其引起靶基因 mRNA 的降解，因此 mRNA 的降解水平是 siRNA 沉默效率的直接证明。一般在 siRNA 转染后 24 小时后即可检测到靶 mRNA 水平的降低，可采用细胞总 RNA 提取，全长 cDNA 合成，荧光定量实验即可检测到 mRNA 的敲除效率。

蛋白水平 - WB 检测：

siRNA 引起靶基因 mRNA 的降解，从而影响了靶蛋白的表达。但蛋白水平检测时间受细胞内目的蛋白表达量、稳定性、半衰期、甚至其他调控等因素的影响，蛋白质水平下降的幅度与 mRNA 水平下降不一定成线性正比关系。一般在转染后 48 小时后开始 WB 检测，并于 72 小时、96 小时甚至更长时间之后多点采样。

小结：RNA 转染过程中的影响因素比较多，主要可以归纳为转染方法、转染试剂和转染细胞等三个方面。除此之外，RNA 的结构、RNA 转染时 RNA 的用量、RNase 的污染、进入细胞后 RNA 的降解等因素也会使 RNA 转染过程更加复杂、给转染结果带来影响，其中 RNA 在转入细胞后的降解问题在 RNA 转染过程中是比较重要的，如果转染的 RNA 在进入细胞体后大量降解，那么实验结果就很不准确了。

说明：本文仅用于传播知识、普及科学，不构成任何医疗建议，如有版权等问题，请随时联系我们。

关于同立海源  

北京同立海源生物科技有限公司，成立于 2011 年，专注细胞和基因治疗（CGT）上游 GMP 级原料试剂研发，致力于为生命科学提供可靠的产品与服务。产品涉及细胞分选磁珠试剂，真核/原核重组蛋白、无血清培养基、细胞培养试剂盒、转染试剂、基因编辑工具酶等。为细胞和基因治疗药物、抗体药物开发、细胞储存等生物制药和 IVD 领域提供核心原料试剂与服务。

公司建有 2000㎡的研发实验室及 GMP 级洁净车间，包括真核与原核蛋白表达工程平台、细胞培养技术开发平台、体外诊断试剂生产平台，通过 ISO13485 和 ISO9001 双认证，部分产品已获美国 FDA DMF 备案。